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產品目錄

分子水平實驗（4）

詳細說明

甲基化檢測服務

實驗原理

DNA甲基化是最早發現的基因表觀修飾方式之一，真核生物中的甲基化僅發生于胞嘧啶，即在DNA甲基化轉移酶( DNMTS)的作用下使CpG二核苷酸5～端的胞喀啶轉變為5”-甲基胞喀啶。DNA甲基化通常抑制基因表達，去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。這種DNA修飾方式在不改變基因序列前提下實現對基因表達的調控。

注:M:甲基化引物PCR擴増;U:非甲基化引物PCR擴増。SW1353細胞在藥物處理后從完全甲基化轉變為完全非甲基化，OUMS-27細胞在5-Aza-dC處理后從部分甲基化部分非甲基化狀態轉變為完全非甲基化。

Northern或 Southern Blot檢測服務

實驗原理

Southern雜交是進行基因組DNA特定序列定位的方法，由 Southern于1975年創建，稱為 Southerne印跡技術。其原理為利用瓊脂糖凝膠電泳分離經限制性內切酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉移至尼龍膜或其他固相支持物上，經干烤或者紫外線照射固定，再與相對應結構的DG標記探針進行雜交，用放射自顯影或酶反應顯色，從而檢測特定DNA分子的含量。

Northerne印跡雜交( Northern blot)是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉印到硝酸纖維素膜上的方法，主要利用堿基配對原則，利用特性的DNA探針與其雜交，經過顯影技術分析RNA的最和大小。RNA印跡技術正好與DNA相對應，故被稱為 Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質印跡技術則被稱為 Western blot

實驗流程

a) Northern Blot

1.完整mRNA的分離

2.根據RNA的大小通過瓊脂糖凝膠電泳對RNA進行分離

3.將RNA轉移到固相支持物上，在轉移的過程中，要保持RNA在凝膠中的相對分布

4.將RNA固定到支持物上

5.固相RNA與探針分子雜交

6.除去非特異結合到固相支持物上的探針分子

7.對特異結合的探針分子的圖像進行檢測、捕獲和分析

b）Southern Blot

1、制備待測DNA2、DNA限制酶消化

3、瓊脂糖凝膠電泳分離待測DNA樣品

4、電泳凝膠預處理

5、轉膜

6、探針標記

7、預雜交

8、 Southern雜交

9、洗膜

10、放射性自顯影檢測

11、實驗結果分析及報告

樣本要求

1.新鮮組織:

用解剖刀等迅速切成小碎塊約30-100mg，放入20mL離心營中開蓋液氮速東15min.80度保存，干冰運輸。每個northern blot泳道提供2-3管樣品。注:解剖刀處理組織的時間盡量控制在1min以內。液氮速凍時必須開蓋以防炸裂。

2細胞樣品:

縣浮細胞1000-1500rpm，5min，常溫離心收集細胞。貼壁細胞用胰蛋白酶消化后吹丁收集，PBS洗滌細胞，去除多余培養基和胰蛋白酶。開蓋液氮速凍15min，-80度保存干冰運輸，一般情況下，細胞培養的6孔板每孔細