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廣州競遠生物科技有限公司
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| 分子水平實驗（2） |
病毒包裝
1.慢病毒包裝
服務簡介
慢病毒( Lentiviruses)屬于逆轉錄病毒科。慢病毒( Lentivirus)載體是以HIV-1(人類免疫缺陷1型病毒)為基礎發展起來的基因治療載體。具有感染譜廣泛、可以有效感染分裂期和靜止期細胞、長期穩定表達外源基因等優點，因此成為導入外源基因的有力工具。現在慢病毒系統已經被廣泛應用到各種細胞系的基因過表達、RNA干擾、 MICRORNA研究以及活體動物實驗中。我公司提供慢病毒載體構建、RNAi( SHRNA)、 MIRNA、過表達和干抗慢病毒包裝以及基于慢病毒技術的穩定細胞系構建服務。靈敏度更高。
整體實驗流程
1.構建質粒
a.慢病毒過表達質粒載體的構建設計上下游特異性擴増引物，同時引入酶切位點，采用PCR技術(采用高保真KOD酶，3K內突變率為09％)從模板中(cDNA質粒或者文庫)調取目的基因CDS區( coding sequence)連入T載體。將CDS區從T載體上切下，裝入慢病毒過表達質粒載體。
b.慢病毒干擾質粒載體的構建合成 SIRNA對應的DNA須環結構，退火后連入慢病毒干擾質粒載體。
c. MIRNA載體構建從 genomic中調取基因相應的Mir前體，并在調取引物中引入酶切位點。2.共轉293T細胞
3.收集病毒
4.病毒轉化、濃縮
5.病毒感染活性鑒定
6.成果交付
質量控制
我們會對每一批病毒都進行滴度檢測，嚴格控制質量，讓你百分百放心。針對用攜帶熒光報告基因的轉移質粒生產的病毒，我們會先用熒光法檢測病毒的轉導率，如能達到使用要求，再進一步采用qPCR法檢測病毒滴度。
2.腺病毒包裝
實驗原理
腺病毒( Adenovirus)是一種沒有包膜的直徑為70-90nm的病毒顆粒，為線狀雙鏈DNA分子，約含35000bp，兩端各有長約100bp的反向重復序列
腺病毒為5型血清型腺病毒，缺失了腺病毒的早期表達基因序列E1區和E3區。E1是腺病毒復制所必須的，E1的缺失使其不能自身復制，只能依靠包裝細胞如HEK293細胞提供的反式互補進行復制擴增，以此保證腺病毒的安全性。E3基因表達的蛋白能對抗宿主的抗病毒防御系統，E3區的去除能減少宿主的體內免疫反應。
腺病毒包裝采用的是*新的 Admax:系統，通過Cre-loxp重組酶，使共轉染到HEK293細胞中的腺病毒載體穿梭質粒和骨架質粒(腺病毒基因組質粒)在重組酶的作用下產生重組腺病毒，獲得的病毒滴度更高，其病毒滴度可以達到1×10^12 pfu/ml
腺病毒載體有CMV、mCMV、CAG、PGK、UbC、EF1a、等多種啟動子可供選擇;而且還有EGFP、 ZSGRE、Tomato、 mcherry、EYF等多種熒光標記蛋白可供選擇。
3.腺病毒相關病毒包裝
實驗原理
腺相關病毒( adeno- associated virus，AAV)，也稱腺伴隨病毒，屬于微小病毒科依賴病毒 |
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