一、Western blot概述
Western Blot采用的是變性聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質混合物，經過SDS-PAGE分離的蛋白質被到轉移到固相支撐物（NC膜，PVDF膜等）上后，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持膜上蛋白質或多肽的抗原性質不變，以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與其對應的抗體起免疫反應，再與酶標記的二抗體起反應，經過底物顯色以檢測特異蛋白質表達水平。
由于Western blot檢測技術具有簡便，快捷等特點，所以目前該技術也被廣泛應用于蛋白質表達水平的檢測。
二、技術服務服務內容
1、蛋白質抽提與定量；
2、Western blot
3、圖片分析；
4、Western blot實驗報告提交。
三、送樣須知，為了保證Western blot實驗能順利進行，樣品寄送需滿足以下要求：
顧客提供：組織、細胞、蛋白質溶液等；一抗（如果公司抗體庫里沒有）。
運輸要求：干冰或液氮包裝寄送，廣州本地客戶可上門收樣。
注：樣本應避免各類污染和反復凍融。
四、實驗報告內容
1、Western blot蛋白質濃度及電泳上樣量；
2、原始膠片和電子圖片、圖片分析結果；
3、Western blot完整的實驗報告,包括實驗步驟、使用儀器和試劑等。
五、實驗案例
六、服務周期及收費標準: 歡迎登陸 www.fitgene.com 服務熱線 400-699-1663
七、服務質量承諾：利用內參精確定量，并提供清晰、客觀的western結果。
附：Western blot 實驗步驟
1、Western blot蛋白質提取：根據實驗目的的不同選擇不同的裂解液，如RIPA裂解液、NP-40裂解液、SDS裂解液，同時根據蛋白質提取組分的不同選擇不同的方法，如提取核蛋白，細胞質蛋白，膜蛋白等。
2、蛋白定量，根據蛋白質的提取條件不同，可采取不同的定量方法，如bradford法、BCA法等。
3、電泳，依據需要檢測蛋白的分子量選取分離膠的濃度，分別配置分離膠和積成膠，凝膠凝固后進行蛋白質上樣和電泳。
4、轉膜，可采取半干法和濕法轉移，當采取半干法轉膜時需防止短路：從下到上的順序：濾紙/PVDF膜/凝膠/濾紙/陰極（bio-rad轉膜儀)。
5、封閉：5%脫脂奶粉或5% BSA封閉過夜或室溫1小時,孵育時間可根據實驗需要進行改變。
6、一抗孵育，5%脫脂奶粉稀釋一抗到合適的濃度，與膜室溫孵育1小時4度過夜，孵育時間可參考抗體說明書，并加以優化，一抗孵育后TBST洗膜3次，每次5分鐘。
7、 二抗孵育，5%脫脂奶粉稀釋二抗到合適的濃度，與膜室溫孵育1小時，TBST洗膜3次，每次5分鐘。
8、顯影(ECL法）：將A、B兩種底物按比例稀釋混合均勻后滴在膜上，置于壓片盒中，迅速蓋上膠片，關閉膠盒進行曝光，曝光一定時間后取出膠片，浸入顯影液中顯影，直到出現清晰的蛋白質條帶，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水沖凈晾干，標定Marker，掃描膠片和Western blot 圖片分析。 |
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