SILAC-IP免疫共沉淀實驗原理
在分離純化誘餌蛋白-互作蛋白復合物過程中,不可避免地會出現非特異結合蛋白,這些蛋白會一并被質譜鑒定出來,成為假陽性的互作蛋白,影響后續挑選驗證。 傳統的判斷假陽性互作蛋白方法是:用誘餌蛋白組鑒定到的蛋白列表,扣除掉對照組鑒定到的蛋白列表,作為“互作蛋白”。但很多真實的互作蛋白,比如豐度比較高的蛋白,在對照組中也會出現,而傳統的方法就會被排除掉。
SILAC技術是先將實驗組和對照組的蛋白帶上不同的同位素,即重鏈、輕鏈氨基酸蛋白。復合物分離后,混在同一管中做酶切質譜等。這樣既能鑒定到復合物蛋白,又能根據同位素峰強度判斷誘餌蛋白組和對照組中蛋白的相對含量,從而更準確地判斷出互作蛋白。
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SILAC-IP實驗技術方案
不同的實驗背景和目的需對應用不同方案,輝駿生物提供以下三種SILAC-IP實驗方案:
方案一:以野生型細胞株為實驗材料
1.分別用輕、重鏈氨基酸培養細胞,取等量標記好的細胞提取蛋白質;
2.提取的輕鏈、重鏈細胞總蛋白分別用Normal IgG和抗bait蛋白的特異抗體做Co-IP;
3.混合輕、重鏈Co-IP產物;
4.胰酶酶切,LC-MS/MS鑒定和定量蛋白。
案二:以過表達誘餌蛋白的細胞株為實驗材料
1. 分別用輕、重鏈氨基酸培養正常對照細胞和過表達誘餌蛋白的細胞株(帶標簽),取等量標記好的細胞分別提取蛋白質,并再次定量;
2. 取等量蛋白混合,用誘餌蛋白抗體做Co-IP;
3. 收集Co-IP后的蛋白液,胰酶酶切,LC-MS/MS鑒定和定量蛋白。
方案三:以干擾誘餌蛋白的細胞株為實驗材料
1. 分別用輕鏈、重鏈氨基酸培養RNAi 誘餌蛋白的細胞株和正常對照細胞株,取等量標記好的細胞分別提取蛋白質,并再次定量;
2. 取等量蛋白混合,用誘餌蛋白抗體 |
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