免疫共沉淀CoIP實驗技術原理
細胞裂解后,孵育結合了抗體的珠子,誘餌蛋白通過其抗體結合到Beads上,同時誘餌蛋白的互作蛋白,也一起“共沉淀”到Beads上。洗滌掉未結合的蛋白后,再用洗脫液將互作蛋白復合物從Beads洗脫下來,便得到免疫共沉淀CoIP產物。CoIP產物既可用Western Blot檢測已知蛋白,也可用質譜鑒定未知蛋白。
當沒有合適的誘餌蛋白抗體時,可以通過表達融合了Flag標簽的誘餌蛋白,利用Flag標簽做免疫沉淀。即細胞過表達Flag-Bait,經裂解后與anti-Flag珠子孵育,誘餌融合蛋白與Beads結合,其互作蛋白“共沉淀”到Beads上,再經洗滌、洗脫后用WB或質譜檢測。
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免疫共沉淀Co-IP
Co-IP技術采用目標蛋白的抗體捕獲樣本中的目標蛋白及其互作蛋白復合物,反應的是體內真實的生理結合,但是不能顯示這些相互作用是直接還是間接的
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pull down
pull down技術將目標蛋白進行體外原核表達,使標簽蛋白(GST或His等)與目標蛋白融合表達,借助標簽的親和介質將目標蛋白純化出來,可以不受抗體、物種限制,比較輕松的獲得目標蛋白的結合蛋白,還可以通過外源同時表達目標蛋白和待測蛋白,確定它們是否發生直接的相互作用
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酵母雙雜交
酵母雙雜交技術是比較古老的一種技術,將目標蛋白和待測蛋白與GAL4 的兩個結構域BD和AD融合表達,在酵母細胞中,2個蛋白的結合使得BD和AD在空間上靠近,從而激活報告基因lacZ的表達。
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熒光雙分子互補(BiFC)
熒光雙分子互補(BiFC)技術將目標蛋白和待測蛋白分別與GFP的兩個片段融合表達,轉染細胞后,2個蛋白的結合使得GFP兩個片段空間上靠近,從而發出綠色熒光,該技術觀測直觀,操作簡便
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熒光共定位
熒光共定位技術依靠熒光確定蛋白質具有相同定位,用于輔助證明而 |
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