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質粒提取原理、方法選擇及常見問題
質粒提取目的
質粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或者表達的重要媒介，這種基因運載工具在基因工程中具有極廣泛的應用價值，要想從細菌中獲得質粒DNA,需要通過質粒提取的方法。
質粒提取的幾種方法及原理
質粒提取主要有堿裂解法，煮沸裂解法，小量一步提取法等。
1、堿裂解法原理：根據共價閉合環狀DNA與線性DNA的拓撲學結構差異來分離的。在強堿環境下，細菌的細胞壁和細胞膜被破壞，基因組DNA和質粒DNA被釋放出來，線性DNA雙螺旋結構被破壞而發生變性。雖然在強堿的條件下共價閉合環狀質粒DNA也會發生變性，但兩條互補鏈仍會互相盤繞，并緊密的結合在一起。當加入pH4.8的乙醋酸鉀高鹽緩沖液使pH恢復中性時，共價閉合環狀質粒DNA復性快，而線性的染色體DNA復性緩慢，細菌蛋白質、破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復合物，后者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當用鉀離子取代鈉離子時，復合物會從溶液中有效地沉淀下來，離心除去變性劑后，就可以從上清中回收復性的質粒DNA。
2、煮沸法裂解：將細菌懸浮于含Triton
X-100和能消化細胞壁的溶菌酶緩沖液中，然后加熱到100℃使其裂解。加熱除了破壞細胞壁外，還有助于解開DNA鏈的堿基配對，并使蛋白質和染色體DNA變性。但是，閉環質粒DNA彼此不會分離，這是因為他們的磷酸二酯骨架具有互相纏繞的拓撲結構，當溫度下降后，閉環DNA的堿基又各自就位，形成超螺旋分子，離心除去變性的染色體核蛋白質，就可從上清中回收質粒DNA。
煮沸裂解法對于小于15kb的小質粒很有效，可用于提取步至lmL（小量制備），多至250mL（大量制備）菌液的質粒，并且對大多數的大腸桿菌菌株都適用。
3、小量一步提取法：由于細菌染色體DNA比質粒大得多,受機械力后細菌染色體DNA會被震斷成不同大小的線性片段而纏繞附著在細胞碎片上，并發生變性。同樣受機械力質粒DNA會變性，機械力消失后復性。但質粒DNA的復性快，仍溶于溶液而細菌染色體DNA復性較慢，會形成不溶的網狀結構，通過高速離心可以分離得到質粒DNA
。
質粒提取方法選擇
質粒提取的方法主要根據質粒DNA分子量的大小，所用細菌的種屬，細菌裂解釋放DNA后的純化方法和實驗要求來選擇。
1、質粒DNA的分子大于15kb時，在質粒抽提過程中容易受損，可以采用比較溫和的裂解方法，將細菌懸浮于等滲 |
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