閃晶生物為您提供全套免疫印跡(western blot)技術服務和相關的試劑耗材。主要實驗步驟如下：
蛋白質抽提
實驗對象為組織樣品，取適量（250~500mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品，加1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑），勻漿后抽提總蛋白（或核蛋白）。
實驗對象為細胞樣品(細胞培養)，每份樣品取1×106～1×107細胞，PBS清洗細胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑）抽提總蛋白（或核蛋白）。
2. 蛋白質定量：按BCA蛋白質定量試劑盒操作說明操作，測定樣品濃度。
3. 變性聚丙烯酰胺不連續凝膠電泳(SDS-PAGE):將準備好的樣品液和預染蛋白marker分別上樣，標準加進第一個孔中，電泳分離蛋白。
4. 蛋白質轉移到PVDF膜,按Bio-Rad蛋白轉移裝置說明組裝濾紙凝膠纖維素夾層，30mA恒流條件下，4°C轉移過夜。
5. western blot膜的封閉和抗體孵育
膜在5％脫脂奶粉溶液中室溫孵育1小時以封閉膜上的非特異結合。
封閉過的膜加入一抗室溫孵育1.5小時，抗原抗體結合。
加入HRP標記的二抗體以結合一抗，室溫孵育膜1小時。加入HRP標記的GAPDH抗體可同時檢測GAPDH含量。
6. western blot結果檢測：化學發光法檢測，膜與化學發光底物孵育，經X膠片曝光顯影。圖片掃描保存為電腦文件，并用GIS1000分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值的數字化。
7. western blot數據分析：目的蛋白的灰度值除以內參GAPDF的灰度值以校正誤差，所得結果代表某樣品的目的蛋白相對含量。
8. 提供實驗報告，包括詳細的實驗方法及免疫印跡實驗結果的相關數據。
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