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北京亞華順達科技有限公司
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| Roche — 潮霉素B |
作用機制：
潮霉素B是由吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)代謝產生的一種氨基糖苷類抗生素，通過抑制蛋白質合成而殺死細菌、真菌和高等真核細胞。潮霉素B通過干擾70S核糖體易位和誘導對mRNA模板的錯讀而抑制蛋白合成。目前常用于篩選和維持培養含潮霉素抗性基因的原核或真核細胞。
抗性基因：
對潮霉素B的抗性源自編碼潮霉素B磷酸轉移酶（Hph）的基因。至今發現兩種來源：
► Streptomyces hygroscopicus產生的Hph抗性基因；
► Escherichia coli，Klebsiella pneumoniae內質粒攜帶的Hph抗性基因（常用）；
生物應用：
1） 篩選和維持培養穩定轉染Hph+載體的原核細胞或真核細胞（植物細胞和哺乳動物細胞）；
2） 由于作用模式的差異，常與G418 (GeneticinTM)，Zeocin™ 和blasticidin S聯合使用，篩選穩定轉染兩個不同載體的細胞株；
雙抗性穩定轉染細胞篩選的抗生素作用機制及抗性
抗生素
抗性機制
抗性基因
哺乳動物篩選濃度
潮霉素B
干擾70S核糖體易位和誘導對mRNA模板的錯讀
Hph
200~500μg/mL
G418
干擾80S核糖體功能和抑制蛋白合成
Tn5/Tn601
100~1000μg/mL
Zeocin
摻入或者切割DNA引起細胞死亡
Sh ble
50~100μg/mL
blasticidin S
核糖體上抑制肽鍵形成
Bsd/BSD
3~50μg/mL
3）抗病毒劑，由于潮霉素B選擇性滲透進入因病毒感染增強通透性的細胞，而且具有抑制翻譯的功效；
4）作為驅蟲藥加入動物飼料；
應用濃度：
潮霉素B用來篩選穩轉株的工作濃度需要根據細胞類型，培養基，生長條件和細胞代謝率而變化。推薦使用濃度為50-1000 μg/mL，*佳濃度需要殺滅曲線來確定。
哺乳動物細胞·200-500 μg/mL；細菌/植物細胞·100-300 μg/mL；真菌·300-1000 μg/mL；
產品使用：
使用一：殺滅曲線確定*佳殺死濃度（僅作參考，因個人檢測體系而異）
（1）往組織培養級的96孔板內加入未轉染細胞，細胞密度約50-200細胞/孔；細胞貼壁之后，往每孔加入含不同濃度（如50-1000μg/mL，至少5個濃度）潮霉素B的200μL新鮮培養基；
（2）37℃，5% CO2培養箱孵育細胞10-14天；
（3）培養5-7天后更換新的培養液，培養液內含有相應濃度的潮霉素B；
（4）10-14天后使用細胞增殖方法如MTT，CCK-8等評估細胞活力；也可以通過檢測細胞克隆數或百分比匯合率來確定毒性效應。一般選擇在10-14天能夠殺死所有細胞的*小濃度為*佳篩選濃度。
使用二：篩選穩定轉染細胞
（1） 對于貼壁細胞，直接吸去60mm培養皿內的轉染細胞培養基，然后加入含有潮霉素B的新鮮培養基5-6ml；對于懸浮細胞，無菌條件250x g,離心10min除去舊的轉染細胞培養基，然后懸浮在約5ml的含潮霉素B的新鮮培養基；
（2） 5-7天后，如上方法更換含有潮霉素B的新鮮培養基；
（3） 再孵育細胞5-7天；
（4） 10-14天孵育后，培養體系中只含有能夠表達潮霉素B抗性表型的活細胞。因此篩選之后如步驟一，更換不含潮霉素B的新鮮培養基。 |
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