目前生物柴油主要采用化學法生產，現正在研究生物酶法合成生物柴油技術。用發酵法（酶）制造生物柴油，混在反應物中的游離脂肪酸和水對酶催化劑無影響，反應液靜置后，脂肪酸甲 酯即可分離。日本大阪市立工業研究所成功開發使用固定化脂酶連續生產生物柴油，分段添加甲醇進行反應，反應溫度為30℃，植物油轉化率達95%，脂酶連續使用100 天仍不失活。反應后靜置分離，得到的產品可直接用作生物柴油。
通過加氫裂化方法也可生產生物柴油，現已開發了幾種新工藝。加氫裂化方法不聯產丙三醇。可將植物油轉化為高十六烷值低硫柴油，可加工寬范圍原料包括高含游離酸的物料。加氫裂化過程中發生幾種反應，包括加氫裂化、加氫處理和加氫。產率為75%～80%，十六烷值高，硫含量＜ 10PPm。28 天后可生物降解95%，而石油基柴油在同樣時間內降解40%。與其他生物柴油比，主要優點是可降低NOx 排放。該工藝采用常規的煉廠加氫處理催化劑和氫 氣，可供煉油廠選用，因有氫 氣可用，可方便地與煉油廠組合在一起。
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