脂肪干細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)方案二：實(shí)驗(yàn)步驟
青島西凱生物技術(shù)有限公司于2010年，是一家以干細(xì)胞，免疫細(xì)胞為核心，結(jié)合jing準(zhǔn)醫(yī)療，致力于“家族生命健康管理”，專注于“干細(xì)胞的研發(fā)儲(chǔ)存及應(yīng)用”，設(shè)有再生醫(yī)學(xué)zhong心、綜合性干細(xì)胞庫、西凱生物干細(xì)胞抗衰美容臨床研究轉(zhuǎn)化基地和培訓(xùn)zhong心。
1、提取制備脂肪干細(xì)胞：向脂肪標(biāo)本儲(chǔ)液瓶中加入標(biāo)本洗滌液，重復(fù)3~4次，直到洗出的廢液比較澄清為止。將洗滌后的脂肪均等的分裝到各個(gè)離心管中，每個(gè)管中加入等量的膠原酶溶液，無菌情況下置入37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中消化30~60min。將消化好的脂肪放入離心機(jī)里離心分離，去除上層脂肪及廢液，用DMEM懸浮細(xì)胞，用100um的濾網(wǎng)過濾掉余下的脂肪組織。吸取過濾后的細(xì)胞懸液少許進(jìn)行計(jì)數(shù)，再次離心過濾后的細(xì)胞懸液。棄去上清，留少量原液，用手指輕彈懸浮細(xì)胞。再按接種瓶數(shù)加適量培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，分裝入各個(gè)培養(yǎng)瓶中，并再在每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入適量完全培養(yǎng)液，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
2、誘導(dǎo)檢測：消化傳代取細(xì)胞，取P2代脂肪干細(xì)胞，以5*105cells接種于50cm2培養(yǎng)瓶中，分別加入上述各組誘導(dǎo)劑，每組復(fù)6孔，每隔3-4天換液一次，連續(xù)誘導(dǎo)分化，于第7天用流式檢測脂肪干細(xì)胞特異表達(dá)因子CD49d，及神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)記nestin。
3、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：取上述nesting含量zui高組為供試品組，以生理鹽水為空白對(duì)照，以脂肪干細(xì)胞為陽性對(duì)照，經(jīng)尾靜脈注射，飼養(yǎng)30天，以觀察各組是否具有毒副作用。陽性對(duì)照組為避免因單次注射細(xì)胞量過大而導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)死亡，因此實(shí)驗(yàn)分高（1*107）、中（1*106）、低（1*105）三個(gè)劑量注射，每組4只，每次注射2ml。 |
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