Pfu酶用途
主要用于對 PCR 保真性要求較高的實驗，如基因篩選、克隆表達、突變檢測、定點突變等等。
Pfu酶特征
• 克隆有 Pyrococcus Furiosis DNA Polymerase 基因的大腸桿菌經誘導表達后，再經三次過柱純化分離出來的一個約 90 KD 的重組蛋白。
• 具有 5' 到 3 ‘合成 DNA 的能力；有 3 '到 5 ‘外切酶的活性即糾錯能力，通俗地說，出錯的機率是普通 Taq 酶的十分之一。為了減少由 3′-5′ 外切酶活性引起的引物降解，閃晶公司強烈推薦在冰浴上添加所有的試劑并且在溫度達到 60 -65°C 時再加入 Pfu DNA 聚合酶以便進行熱啟動或者在冰浴上添加試劑后放在預熱到 95°C 的 PCR 儀上。
• 無 5 ' 到 3 ‘外切酶的活性， 不能用于實時熒光PCR 。
• 無 3 ‘端加 A 的功能，產物為平端，如果需要做 T － A 克隆，需要做添 A 實驗。
• 無外源核酸酶和細菌 DNA 污染。
• SDS － PAGE 檢測，純度＞ 95% 。
• 延伸溫度 72 ℃ ， Mg 2+ 濃度 2.0mM ， dNTPS 濃度 0.2mM ，延伸速度為 600base/min ； Pfu DNA 聚合酶比 Taq DNA 聚合酶的延伸反應速率低，因此閃晶公司推薦延伸反應時間為每 kb 需 2 分鐘。
• 10 × PCR buffer: 500mM KCl, 100mM Tris-HCl (pH 9.0 ， 25℃ ), 1% TritonX-100 和 20mM MgSO4 。
• Storage buffer: 20mM Tris-HCl (pH 8.0), 100mM KCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 50% 甘 油， 0.5% Nonidet -P40 和 0.5% Tween20 。
Pfu酶單位定義
在 74℃ 條件下， 30 分鐘內催化 10nmol dNTP 的摻入反應成為酸不溶性物質所需的酶量為一個單位。反應條件為： 50mM Tris-HCl (pH 9.0 ， 25℃ ), 50mM NaCl, 5mM MgCl2, 200mM dNTP( 含未標記和標記 [3H] dTTP ), 10mg 活化的小牛胸腺 DNA 和 0.1mg/ml BSA, 終反應體積為 50ml 。
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